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人體自身抗體檢測技術綜述

時間:2019-06-20 來源:國際檢驗醫學雜志 作者:武永康,張乃丹,翟建昭 本文字數:8092字

  摘    要: 自身抗體對于自身免疫性疾病的診斷、鑒別診斷、療效觀察及預后判斷具有重要意義。近年來, 隨著抗體篩選新技術的應用, 更多種類的自身抗體被發現, 其應用范圍除自身免疫性疾病外, 已擴展至神經系統疾病、腫瘤、消化、生殖及移植等領域。目前, 自身抗體檢測仍存在試劑參比溯源、檢測過程一致性、結果同質互認等問題。制訂試劑溯源及標準化操作規范將會引導自身抗體檢測向自動化、微量化、智能化、高敏感、高通量的方向發展, 以便更好地為臨床服務。

  關鍵詞: 自身抗體; 標準化操作; 篩選技術; 展望;

  Abstract: Autoantibodies are very important for autoimmune disease to diagnosis, differential diagnosis, curative effect and prognosis.Recent years, with the application of the new antibody screening technology, a growing many kinds of autoantibodies were discovered, and the scope of its application has been expanded to nervous system disease, tumor, digestive and reproductive and other fields besides autoimmune disease.At present, there are many problems in autoantibody detection, such as the reagent cannot be compared with the source, the detection process is inconsistent, and the results cannot be homogenized.The development of guidelines for the traceability and standardization of reagents will guide to the direction of automation, micromation, intelligence, high sensitivity and high throughput, in order to serve for clinic better.

  Keyword: autoantibody; standardized operations; screening technology; prospects;

  自身抗體是指針對自身組織、器官、細胞、細胞亞結構、體內蛋白分子、體內核酸等所有自身抗原的抗體總稱, 其本質為機體B細胞分泌的免疫球蛋白[1]。自身抗體分為生理性自身抗體 (或稱天然自身抗體) (NAbs) 和病理性自身抗體 (PABs) 。有研究顯示, 生理性自身抗體是維持機體處于健康狀態的重要物質, 多為IgM型, 參與機體正常新陳代謝, 減少體內細胞凋亡物質的堆積[2]。當機體免疫調節功能受損時, 體內自身抗體大量產生, 多為IgG型, 與自身抗原親和力高, 形成的免疫復合物通過FcγR激活炎性介質 (細胞因子) 或補體系統, 導致自身免疫性疾病的發生, 這種具有致病損傷作用的自身抗體即為病理性自身抗體, 即通常所稱的自身抗體[3]。

  1、 自身抗體的種類

  自身抗體種類很多, 通常采用兩種分類方法, 一種為以疾病為中心, 即相關自身抗體與該疾病有關, 該分類法對于臨床醫生自身抗體項目申請具有重要意義, 同時也有助于對該疾病與自身抗體的全面認識;另一種為以靶抗原為中心, 即其命名為抗靶抗原抗體, 這有助于對自身抗體性質的認識, 也有助于對自身抗體對靶向組織攻擊造成機體損傷的理解。從理論上講, 機體內存在多少種抗原, 就能產生多少種自身抗體, 因此, 自身抗體錯綜復雜, 種類可達成千上萬種, 自身抗體的命名應盡量根據抗體所針對的抗原進行, 便于名稱的統一。以靶抗原為中心的自身抗體分類見圖1。

人體自身抗體檢測技術綜述

  1.1、 常規自身抗體

  隨著自身免疫學科的發展及檢驗技術的逐漸普及, 自身抗體已成為大多數醫療機構的常規檢測項目, 包括抗核抗體 (ANA) , 抗核抗體譜[包括抗DNA、抗組蛋白及抗可提取性核抗原 (ENA) 抗體譜等], 抗中性粒細胞胞漿抗體[包括抗蛋白酶3抗體 (抗PR3) 、抗髓過氧化酶抗體 (抗MPO) 等], 抗磷脂抗體 (包括抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白I抗體、抗磷脂酰絲氨酸抗體等) , 類風濕關節炎抗體 (包括抗CCP抗體、類風濕因子、抗角蛋白抗體等) , 自身免疫肝病抗體 (包括抗平滑肌抗體、抗線粒體抗體、抗肝腎微粒體-1抗體等) , 肌炎相關抗體 (包括抗Mi-2、抗信號識別顆粒抗體、抗PM-Scl100等) , 糖尿病抗體 (包括谷氨酸脫羧酶抗體、胰島素抗體和胰島細胞抗體等) 。其中ANA與抗核抗體譜是臨床開展最為普遍的兩類項目。ANA泛指抗各種核及胞漿抗原成分的一大類抗體, 推薦采用以HEp-2細胞為底物的間接免疫熒光法進行檢測。而抗核抗體譜是指針對明確純化抗原抗體的集合, 其與傳統的ENA抗體譜有所不同, 傳統ENA抗體譜檢測通常采用磷酸鹽緩沖液提取動物胸腺細胞核蛋白作為抗原底物[4]。但由于核成分中的DNA和組蛋白等堿性成分無法被磷酸鹽緩沖液 (pH=7.2) 提取, 因此, 傳統ENA抗體譜并未包括抗DNA抗體和組蛋白抗體等堿性靶抗原的抗體。

  隨著蛋白重組技術的進步, 幾乎所有蛋白分子均可重組合成, 目前臨床上很少采用傳統Western-blot法進行ENA抗體譜的檢測, 從理論上講, 合成純化抗原檢測結果準確可信, 且抗核抗體譜的檢測范圍遠大于ENA抗體譜的范圍。ENA抗體譜概念不再被使用, 因此, 采用大量重組蛋白的抗核抗體譜檢測試劑盒在臨床上已趨普及, 并被廣大學者所接受。ANA熒光圖型與抗核抗體譜靶抗原對應關系見圖2。

  圖1 以靶抗原為中心的自身抗體命名分類圖
圖1 以靶抗原為中心的自身抗體命名分類圖

  1.2 、新型自身抗體

  隨著蛋白重組及自身抗體篩選技術的發展, 大量新型自身抗體集中涌現, 其中主要包括傳統自身免疫疾病發現的一些自身抗體, 另外在其他領域如神經系統疾病、腫瘤、生殖、消化系統疾病等也出現了一些新型自身抗體, 為其應用拓展了范圍。腫瘤患者自身抗體反應通常與腫瘤組織或血清中的腫瘤相關抗原 (TAA) 的異常或過度表達相關, 大部分的腫瘤自身抗體都是由TAA誘導產生的, 為腫瘤的診斷和鑒別診斷提供了新的實驗依據。近年來出現的新型自身抗體見表1。

  圖2 ANA熒光圖型與抗核抗體譜靶抗原對應關系
圖2 ANA熒光圖型與抗核抗體譜靶抗原對應關系

  表1 近年來出現的新型自身抗體
表1 近年來出現的新型自身抗體

  2、 自身抗體篩選和發現

  新型自身抗體的發現對于疾病診斷和認識具有重要意義。目前以HEp-2細胞為基質的ANA檢測及以肝、腎組織為基質的ANCA和GBM檢測已經在臨床廣泛開展[21,22], 而臨床實踐過程中, 相當數量的醫師和技師只關注熟悉已知的熒光抗體模型, 對于特殊少見熒光模型很多情況下都主觀認為是非特異性染色或雜質而忽略。實際上, 臨床工作中遇到未知熒光抗體模型時應做詳細記錄, 并結合患者疾病或臨床癥狀進行分析, 從而可能發現新的熒光模型與疾病之間的關系, 有利于新型自身抗體發現。

  此外, 傳統的Western-blot法也是發現新型自身抗體的檢測方法。由于ENA抗原蛋白分離帶非常多, 臨床上會發現一些所謂的“雜帶”, 這些雜帶可能就是與疾病相關的新型自身抗體, 但臨床實踐中也常被忽略。目前, 由于該法檢測ENA抗體譜的局限性, 以及檢測結果的不確定性, Western-blot法檢測ENA抗體譜已很少使用, 取而代之采用純化抗原的線性免疫印跡法、化學發光法或液相芯片技術進行檢測。

  雖說上述兩種方法具有發現新型自身抗體的可能性, 但熒光抗體檢測基質及ENA提取物抗原種類有限, 基質并未包括人體所有的抗原物質, 這是發現新型自身抗體的內在缺陷。目前已發展出一些高效篩選自身抗體的方法。

  2.1、 重組cDNA表達文庫的血清學分析 (SEREX)

  SEREX技術是自身抗體篩選的重要手段, 通過提取患者組織mRNA反轉錄成cDNA后導入噬菌體, 并溶原性感染大腸桿菌構建cDNA表達文庫, 將表達產物轉印在硝酸纖維膜上, 之后與患者血清反應, 然后對陽性克隆進行PCR測序鑒定即可得知抗原種類, 同時也選出相應的自身抗體。

  2.2、 噬菌體展示技術

  噬菌體展示技術是將外源基因插入噬菌體衣殼蛋白基因, 使外源蛋白表達在噬菌體表面, 大量表達外源蛋白的單個噬菌體構成噬菌體文庫, 展示的蛋白和血清中IgG自身抗體反應后, 篩選陽性噬菌體并擴增鑒定, 并采用測序方式確定自身抗原。

  2.3、 蛋白芯片技術

  首先, 納入一定數量的研究患者及匹配的對照, 從而尋找患者與對照最為顯著差異表達的信號, 之后將選定的差異自身抗體在大范圍患者確認, 以確定選定自身抗體診斷疾病的有效性。目前, 眾多學者已嘗試采用約20 000個重組人蛋白的芯片, 系統性地發現免疫相關疾病及腫瘤的自身抗體[23]。

  3、 自身抗體檢測新技術

  二十世紀50年代中期至80年代后期的30余年間, 自身抗體的檢測方法主要有間接免疫熒光法、放射免疫法、被動血凝法、顆粒凝集法、對流免疫電泳法、免疫雙擴散法、放射免疫沉淀法、免疫印跡法等, 主要從細胞及蛋白多肽水平認識自身抗體。對于上述檢測方法而言, 鑒于間接免疫熒光法檢測結果的直觀性、自身抗體檢測的廣泛性, 在今后一段時間內, 該方法仍將是不可替代的篩選檢測方法。

  上述自身抗體檢測方法多為半定量的方法, 難以標準化, 使疾病診斷的特異度、靈敏度受到限制。上世紀90年代后, 隨著純化靶抗原技術的進步, 試劑廠商采用純化抗原制作試劑, 提高了自身抗體的檢測速度和準確性。自身抗體的檢測主要朝2個方向發展, 即多個自身抗體同時檢測的高精度、高通量檢測方法的液相芯片技術 (又稱多元流式點陣儀) 和單項自身抗體精確檢測的化學發光法。兩種檢測方法均為高精度、全自動化大型檢測儀器, 但其各有特點, 前者一次檢測項目最多達100多項, 但其必須組合項目同時檢測, 對于初診患者而言, 確實可以通過多個疾病的自身抗體組合, 很快檢測出相關疾病的自身抗體, 但其醫療成本較高, 對于確診患者, 只需要檢測單個或數個曾檢測出的陽性自身抗體即可, 這對于液相芯片而言, 多項檢測將造成資源浪費。隨著醫療改革的推進, 居民醫療將按疾病種類進行保險支付, 可促使醫院及醫生進行精確檢測節約醫療成本。若液相芯片單個檢測無法降低成本的情況下, 化學發光法將顯示出其獨特優勢, 可單個項目檢測, 且成本可控, 因此, 試劑儀器生產商將會對檢測技術及檢測成本進行競爭, 讓臨床能夠得到更多、更好的選擇。

  4、 自身抗體檢測標準及共識

  標準或共識是專家對現狀討論分析后的操作建議。自身抗體檢測共識的建立恰恰是因為自身抗體檢測不規范、不統一、結果可比性差的現實背景下達成的一致意見。行業協會為提高檢測質量及結果可比性做出了不懈努力。到目前為止, 主要有兩類常規自身抗體 (ANA及ANCA) 制定了部分規范。

  4.1、 ANA檢測規范

  2014年歐洲自身免疫標準化促進會和自身抗體標準化委員會共同發表了《抗核抗體檢測的國際建議》。2014年8月在第12屆自身抗體和自身免疫國際研討會議上, 形成ANA熒光模型國際共識, 提出關于ANA熒光模型標準化分類命名的國際共識。中國醫師協會風濕免疫科醫師分會自身抗體檢測專業委員會于2018年在中華檢驗醫學雜志上發表了中國ANA檢測共識[24], 主要建議包括: (1) 推薦以HEp-2細胞為實驗基質的IIF法是進行ANA檢測的參考方法和首選方法; (2) 建議ANA檢測時, HEp-2細胞在實驗基質中每顯微鏡視野 (放大倍數為200倍) 應可見3~5個有絲分裂細胞; (3) 二抗應使用熒光素標記的抗人IgG抗體; (4) IIF法檢測ANA的稀釋方法可根據不同的檢測試劑而采用倍比稀釋系統或根號10稀釋系統; (5) 當臨床高度疑診時, 不論ANA總抗體的檢測結果如何, 都需要對針對靶抗原的特異性自身抗體進行檢測; (6) 對ANA熒光模型做了相應要求, 必報熒光模型包括:均質型、斑點型, 細胞核致密斑點型、著絲點型、核點型、核仁型、胞漿顆粒型、線粒體型、高爾基體型、棒環狀型、核膜型, 肌動蛋白型。

  4.2、 ANCA檢測規范

  近年來發表了ANCA檢測共識[25,26], 其主要意見如下: (1) 當患者表現為腎小球腎炎 (特別是快速進展的腎小球腎炎) 、有系統特征的皮膚型血管炎, 多個肺結節、上呼吸道慢性破壞性疾病、長期鼻竇炎或耳炎、聲門下氣管狹窄、多發性單神經炎或其他周圍神經病變、眶后腫塊、鞏膜炎等需檢測ANCA; (2) 檢測抗MPO抗體、抗PR3抗體的高質量方法應作為ANCA的篩查實驗; (3) 若抗MPO抗體、抗PR3抗體陰性, 但臨床高度懷疑小血管炎時, 應推薦到有經驗的實驗室進行檢測; (4) 抗MPO抗體、抗PR3抗體陰性時, 不能排除腺相關病毒 (AAV) ; (5) 抗MPO抗體、抗PR3抗體陽性有助于診斷AAV, 但不能僅憑此診斷。

  5、 自身抗體檢測的問題及發展方向

  自身抗體檢測結果在同質化和結果互認方面存在很大障礙, 原因主要有以下兩個方面, 第一為試劑溯源問題, 目前關于抗原試劑性能評價并無可以溯源參比的國際組織, 因此, 檢測結果通常會出現抗體滴度強弱不等。當廠商試劑對比檢測結果出現差異時, 無法確定哪家試劑檢測準確度較高, 臨床通常采用檢測結果與臨床疾病診斷符合率進行分析, 這雖說是一種比較好的評價方法, 但大多數自身免疫病的診斷標準多為多項指標綜合判斷, 患者疾病異質性大, 特別是要評價的自身抗體檢測指標往往是輔助指標, 自身抗體在疾病預示價值方面存在缺陷, 該指標在增加靈敏度的同時必然會損失特異度, 因此給臨床和實驗室造成巨大困難, 這將是今后自身抗體檢測面臨的最大問題。第二為實驗操作問題, 目前多數自身抗體檢測仍以手工操作或半自動儀器檢測為主, 檢測結果仍受檢測方法、檢驗試劑、檢驗儀器及實驗人員的經驗性等諸多因素影響, 特別是熒光抗體檢測受人為因素影響更大, 包括熒光顯微鏡的質量、技術人員對圖像的認識、熒光強度的感知、視力的好壞等。目前已有醫院開始采用電腦圖像采集, 然后通過觀察顯示器上圖像進行結果判讀, 這也帶來新的問題, 如各公司圖像采集卡的質量和參數不同, 顯示器分辨率及顯卡質量等存在很大差異, 同一圖像在不同條件下可以得出完全不同的結果, 這一點值得實驗室工作人員注意。

  不久的將來, 自身抗體檢測將迎來短期粗獷的發展和長期規范的調整。隨著自身抗體篩選新技術的廣泛應用, 將篩選出與各系統疾病有關的新型自身抗體, 對于疾病診斷、鑒別診斷及發病機制的研究將提供重要的實驗依據。此外, 為了更好地將自身抗體檢測結果應用于臨床, 并達到結果互認, 建議國際國內行業協會等部門牽頭制訂試劑溯源及標準化操作規范, 從頂層設計或行業強制標準的高度規范自身抗體檢驗的試劑生產商、檢測實驗室及臨床醫生應用行為。從發展的角度而言, 自身抗體檢測最終將實現全自動化、高通量、標準化和人工智能, 從而顯著提高自身抗體檢測質量, 實現不同實驗室結果互認, 提高實驗室臨床服務能力。

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